本作的前半部份发生于《生化危机2》之前，女主角吉尔于洋馆事件后，一直调查有关安布雷拉公司的地下业务。当时美国联邦决定以核弹彻底毁灭浣熊市，吉尔于是展开她的逃亡之旅。在逃亡期间，她受到安布雷拉公司欧洲分部派来浣熊市的生物武器追击者（Nemesis）追杀，并且遇上了隶属于Umbrella Biohazard Countermeasure Service（UBCS）的男主角卡洛斯，以及UBCS成员Mikhail Victor、Nicholai Ginovaef。吉尔不幸受到追击者攻击而感染了T-病毒，于是卡洛斯便到安布雷拉公司旗下的附属医院寻找解药。
本作的后半部份发生于《生化危机2》之后，吉尔已经康复过来，于是继续出发逃命。此时美国联邦已经准备发射导弹实施“灭菌作战计划”，吉尔需要在15分钟内离开浣熊市。最后，在垃圾处理场成功击倒追击者，并且与卡洛斯乘坐直升机离开（直升机驾驶员很可能是巴利）。